Thành viên:Naazulene/MicroDNA

CpG-islands characteristic in microDNA compared to a single C-G bp.

MicroDNA là phân loại DNA vòng ngoài vùng nhân (eccDNA) chiếm số lượng nhiều nhất trong tế bào người. Chúng thường dài từ 200 dến 400 cặp base, chứa nhiều trình tự không lặp lại và có mật độ exon cao. Thêm vào đó, microDNA đã được phát hiện là đến từ những vùng giàu CpG (các vùng này thường được tìm thấy ở 5'UTR và 3'UTR) - tức các đảo CpG. MicroDNA được tạo ra từ những vùng có phiên mã nhiều, nên có giả thuyết cho rằng nó chỉ là một phụ phẩm của việc sửa chữa DNA phiên mã (bao gồm tái tổ hợp tương đồng và không tương đồng). MicroDNA cũng được cho là phụ phẩm của một số hoạt động sửa chữa DNA khác, bao gồm "lỗi trượt nhân đôi" xuất hiện khi mạch mẫu của microDNA có 2 đến 15 bp lặp lại ở đầu.

MicroDNA là một phát hiện mới, nên chức năng của nó trong tế bào vẫn chưa được thấu hiểu hoàn toàn. Tuy nhiên, người ta đang cho rằng nó ảnh hưởng đến cân bằng nội môi bằng cách đính vào nhân tố phiên mã và hiện đang được sử dụng để phát hiện ung thư.

Phát hiện

MicroDNA được phát hiện qua một quá trình tương tự chiết xuất eccDNA. Cụ thể, người ta đã phát hiện ra microDNA khi đang nhân bản eccDNA bằng phương pháp MDA (khuếch đại dời chỗ nhiều lần) và giải trình tự bằng phương pháp Sanger. Ngày nay, khi phương pháp HTS (giải trình tự thông lượng cao) trở nên phổ biến, người ta đã giải được trình tự của tất cả eccDNA ở động vật có vú bằng cách xác định trình tự của các sản phẩm khuếch đại từ eccDNA. Các phương pháp tính toán tin học sau đó đã được sử dụng để nhận biết các đoạn giao trong chuỗi DNA.

Từ khi được khám phá, microDNA đã được nhận diện ở mọi loại mô từ nhiều mẫu thử khác nhau, bao gồm mô của chuột và các dòng tế bào ung thư của người. Tuy nhiên, mỗi loài đều có những vùng genom độc nhất để sản xuất microDNA. Vì có nhiều vùng genom chung sản xuất microDNA ở các loại tế bào và mô khác nhau trong cùng một loài, có thể cho rằng chúng không đơn thuần là phụ phẩm của quá trình nhân đôi DNA. Tuy nhiên, có những nghiên cứu đã chỉ ra rằng những nhóm microDNA riêng biệt được chiết xuất từ các dòng tế bào của các mô khác nhau, gợi ý rằng sự hình thành của microDNA có thể liên quan đến dòng tế bào và những môi trường phiên mã độc nhất tiềm thấy ở các loại tế bào khác nhau.

Phát sinh sinh học

Typical R-loop formation where the single-stranded DNA can become microDNA.

Dù vẫn còn nhiều điều chưa rõ về sự hình thành của microDNA, người ta cho rằng nó được hình thành trong quá trình sửa chữa DNA phiên mã vì những vùng sản xuất ra microDNA cũng là những vùng có hoạt động phiên mã cao/mật độ exon cao. R-loop, tức thể lai DNA:RNA mạch ba hình thành trong phiên mã (xem hình bên), cũng thường được hình thành tại đảo CpG ở 3'UTR và 5'UTR, tương tự như microDNA. R-loop liên quan đến tổn thương DNA và tính bất ổn định di truyền, điều này ám thị rằng microDNA được hình thành trong sửa chữa R-loop, từ vòng lặp DNA mạch đơn (ssDNA).

Khi các đoạn DNA lặp, ngắn, trực tiếp (như vùng sườn của mạch gốc của microDNA) nhân đôi, sự hình thành vòng lặp DNA trên mạch mẫu hoặc mạch con có thể diễn ra bằng vì lỗi trượt nhân đôi. Để loại bỏ vòng lặp, tế bào có thể sử dụng con đường MMR (sửa chữa ghép đôi lệch) và khi thắt các đầu lặp của DNA, microDNA mạch đơn có thể phát sinh. MicroDNA mạch đơn đó (ss microDNA) sẽ được chuyển thành microDNA mạch kép qua một quá trình chưa biết rõi.Cần ghi chú rằng nếu vòng lặp hình thành trên mạch con,

In DNA replication of short direct repeats (as found in the flanking regions of microDNA gene sources), it is possible for DNA loops to form, on the parent or product strand, through replication slippage. To repair this, the mismatch repair (MMR) pathway can remove the loop and upon ligation of the repeating ends, single-strand microDNA can be produced. The ss microDNA is then converted to double-stranded DNA; this process is still unknown. It is important to note that if the loop is formed on the newly replicated strand, there is no consequential deletion in the genome while microdeletions can form from excisions in the template strand. To understand the role MMR may have in microDNA biogenesis, analysis of microDNA abundance was performed in DT40 cells upon removal of MSH3, an essential protein in MMR. The resulting microDNA from the DT40 MSH3-/- cell line had a higher enrichment of CpG-islands compared to the wild-type as well as an over 80% reduction of double-stranded microDNA. Thus, it is hypothesized that the MMR pathway is essential for microDNA production from non-CpG islands in the genome while CpG enriched microDNA are formed by a different repair pathway.

Transmission electron microscope image of isolated microDNA from DT40 cells.

Again, because of the microhomology on the template genome, if there is a DNA break or a pause in replication (replication fork stalling), the newly synthesized DNA can circularize into ss microDNA. This means when the template DNA is repaired after the creation of the microDNA, there is no deletion.

MicroDNA created through the MMR pathway and replication fork stalling is a result of errors in DNA replication, however, there is evidence of microDNA being present in non-dividing cells as well. This means that some microDNA is produced through repair pathways that also occur in quiescent cells, such as from 5' ends of LINE1 elements that are known to transpose. To move around the genome, DNA transposons require transposase to remove the transposon from its original site and catalyze its insertion elsewhere in the genome. Thus, the transposon is created by two double-stranded DNA breaks, also creating a microdeletion in the DNA. This dsDNA fragment can be circularized through microhomology-mediated circularization, creating a ds microDNA.

Ứng dụng

Liên kết với Nhân tố Phiên mã

Vì chỉ dài từ 200-400 bp, microDNA quá nhỏ để mã hóa protein, tuy nhiên, nó có thể đóng vai trò làm "bọt biển phân tử". Nhân tố phiên mã thường liên kết với vùng promoter hoặc trình tự điều hòa ở đầu 5' của DNA để khởi đầu phiên mã. Những trình tự này cũng xuất hiện trên microDNA vì microDNA phát sinh từ đoạn 5'UTR của mạch mẹ, nên các nhân tố phiên mã cũng có thể đính vào microDNA. Do đó, microDNA có thể đóng vai trò như một chiếc bọt biển hút các nhân tố phiên mã. Điều này nghĩa là microDNA cũng đóng vai trò gián tiếp trong điều hòa biểu hiện gen và cân bằng nội môi phiên mã.

Ứng dụng trong Ung thư

Nhìn chung, các phân tử acid nucleic tự do trong máu, gọi là acid nucleic tuần hoàn hoặc cfNA (acid nucleic không có tế bào), là một dấu hiệu bệnh khá mới đang được nghiên cứu, nhằm chẩn đoán và theo dõi bệnh ung thư. Những phân tử này được phóng thích vào máu khi tế bào chết và trong trường hợp ung thư, có thể được nhận biết qua những trình tự gen gây ung thư đã xác định.

Những nghiên cứu gần đây đã mở rộng thêm các cách sử dụng cfNA (mà cụ thể là microDNA) như các dấu chỉ thị sinh học. Khi quan sát được những điểm tương đồng của cfmicroDNA từ huyết tương của người và chuột với microDNA trong tế bào, người ta đã kết luận được rằng cfmicroDNA được sản xuất trong tế bào. Tương tự, khi so sánh mô phổi trước và sau khi loại bỏ khối u, người ta không phát hiện được nhiều sự khác biệt về các tính chất đặc trưng của microDNA tuần hoàn, trừ việc chúng có độ dài nhỉnh hơn một tí trước khi loại bỏ khối u (sau khi loại bỏ khối u, cfmicroDNA ngắn hơn).

cfDNA được loại bỏ khỏi máu rất nhanh, nên không dễ để dùng chúng làm dấu chỉ thị sinh học. Tuy nhiên, vì DNA vòng miễn nhiễm với RNAase và exonuclease, chúng bền hơn DNA mạch thẳng. Khi kết hợp với phương pháp quan sát sự dài ra của cfmicroDNA trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư, microDNA tuần hoàn trở nên hữu ích để làm chất chỉ thị ung thư, kể cả trong quá trình chẩn đoán và trong điều trị.

Cell-free DNA is quickly cleared from the blood, making it a difficult cancer biomarker. However, because circular DNA is not susceptible to DNA breakage by RNAse and exonuclease, it is more stable than linear DNA. In combination with the observed lengthening of cfmicroDNA in cancer patient serum, this makes circulating microDNA a good cancer biomarker for both diagnosis and progression after treatment.

See also

• Extrachromosomal DNA
• Extrachromosomal rDNA circle
• Selfish genetic elements
• Double minute