Thành viên:Hanhvu003/nháp I

Mục tiêu

Phân hủy rơm rạ bởi chủng vi sinh vật Schizophyllum commune

Phuơng pháp

Vật liệu

- Rơm rạ thu gom được ở vùng ngoại thành phía Nam thành phố Hồ Chí Minh.

- Chủng vi sinh vật Schizophyllum commune do phòng TN Chuyển hóa Sinh học cung cấp - Môi trường PDA (dang thạch nghiêng), môi trường traced element solution, môi trường Kirl basal bổ sung dung dịch glucose 1% (w/v), acetic acid khan nhỏ giọt (Acid α-glucosidase ≥ 99%), dung dịch đệm Na-malonate, hỗn hợp axit axetic và xút tỷ lệ 1:1, hydroxylamine hydrochloride, axit axetic 99%, đệm citrate phosphate (100 mM; pH 4,8); các dung dịch dùng trong các khảo sát quang của enzym.

Phuơng pháp

Xử lý vật liệu sinh học

Sấy khô ở nhiệt độ 60^oC và nghiền nhỏ thành hạt có đường kính từ 0,5-1mm.

Nuôi cấy chủng vi sinh vật

- Nuôi cấy Schizophyllum commune trên môi trường thạch nghiêng ở 28^oC ở pH=4,5 trong 5 ngaỳ → Bảo quản ở nhiệt độ 4^oC. - Chuẩn bị môi trường Kirl basal bổ sung dung dich glucose 1% (w/v) (môi trường khảo sát điều kiện) - Chuẩn bị môi trường traced element solution để sử dụng làm chất cấy (duy trì pH=4,5) → huyền phù 5-7 ngày → Bảo quản và sử dụng để cấy.

Khảo sát các điều kiện

Khảo sát điều kiện thời gian (48, 96, 144, 192, 240 h), pH (3,4,5,6,7) và nhiệt độ (20,25,30,35,40 ^oC), cố định nguồn C (molasse) và N (ammonium sulphate) (tỉ lệ C:N là 20:1). Sử dụng MnSO4 với vai trò là chất điều hòa biểu hiện của Schizophyllum commune.

Sản xuất và chiết xuất enzyme ligninolytic

Bỏ môi trường Kirl basal 66% (w/v) đã khử trùng vào trong bình Erlen → Làm ẩm và bỏ rơm rạ đã xử lý vào môi trường SSF trong bình tam giác Erlen nồng độ gấp 3 lần (duy trì pH bằng 5 trong môi trường nuôi cấy) → Bổ sung 4mL dung dịch nuôi cấy đã huyền phù → Nuôi cấy ở nhiệt độ 35^oC trong 144 h (tỉ lệ C:N là 20:1, MnSO4 là chất trung gian điều hòa) → Thu dung dịch sinh khối sau nuôi cấy vào 10ml nước cất → Lắc, ly tâm và thu dịch lọc.

Xét nghiệm hoạt tính enzymes

Sử dụng quang phổ để đo sự oxy hóa của enzym. Lưu ý chuẩn bị dung dịch đệm cho các phản ứng khảo sát enzym.

- Hoạt tính Mangan peroxidase: Theo dõi sự hình thành phức manganic-malonate ở 270 nm.

- Hoạt tính Ligase peroxidase: Theo dõi sự oxy hóa phụ thuộc H₂O₂ của veratryl thành veratraldehyde ở 25 ° C

- Hoạt tính Laccase: Theo dõi 2, 2 azinobis (3-ethylbenzthiazoline) oxy hóa 6 sulphonate (ABTS) trong dung dịch đệm Na-malonate ở bước sóng 436 nm.

Xác định lignin và tỉ lệ phân tách

Các chất nền chưa được xử lý và enzym phân giải lignin được xử lý được phân tích về hàm lượng lignin và phần trăm phân tách theo Johnson và cộng sự. (1961) với một số chỉnh sửa nhỏ: - Hòa tan mẫu bằng 10 mL 25% (w/v) acetyl bromide trong acetic acid khan nhỏ giọt (Acid α-glucosidase ≥ 99%; acid đã được chưng cất ở 70—72^oC trong 30 phút) → Bổ sung dung dịch vào trong ông nghiệm phân hủy đặc biệt có nút đậy thủy tinh vào để trong 30 phút → Chuyển mẫu đã hòa tan vào bình định mức 200 mL có chứa 5 mL hỗn hợp axit axetic và xút theo tỷ lệ 1:1 có bổ sung 0,2 g hydroxylamine hydrochloride. → Pha loãng mẫu đến thể tích 15 mL bằng axit axetic 99% → Trích và đo bước sóng quang phổ ở 270nm.

Sự tạo saccharicde của quá trình loại lignin ra khỏi hỗn hợp chất lắng

Ủ chất tải rắn 5% (5g trọng lượng khô trên 100ml) với 10 mL chiết xuất cellulase có bổ sung đệm citrate phosphate (100 mM; pH 4,8) trong 72 giờ → Lắc và ly tâm dung dịch ủ → Thu dung dịch nước đem đi phân tích nồng độ glucose và cellulose.

Phân tích thống kê

Toàn bộ các bước xử lý cũng như khảo sát enzyme được thực hiện 3 lần, dữ liệu được xử lý bằng ANOVA theo CDR (thiết kế biến thí nghiệm ngẫu nhiên). So sánh số liệu được thực hiện theo Duncan's Multiple Range Test (MRT). Số liệu được biểu diễn dưới dạng số liệu $\pm$ sai số chuẩn như hình.

mồi xuôi

và

Không có

mồi ngược

Phạm vi áp dụng của tài nguyên sinh học máy tính và tin sinh

Tóm tắt: Các công cụ sinh học tính toán cũng như tin sinh giúp tạo ra các phân tử DNA,RNA và protein một cách lý tưởng, do vậy chúng có thể được sử dụng để nghiên cứu cơ sở phân tử của quá trình xử lý sinh học các vật liệu độc hại cũng như cung cấp những dự đoán và hiểu biết quan trọng liên quan đến một số khía cạnh của quá trình phân hủy và loại bỏ độc tố. Việc hiểu rõ các cấu trúc 3D của các enzyme cũng được xem là một yếu tố cần thiết để nghiên cứu cơ chế của quá trình phân hủy sinh học này (do quá trình tham gia phân giải enzym vi sinh vật có thể dễ dàng dự đoán và nghiên cứu được), với sự trợ giúp của các nguồn dữ liệu cấu trúc enzym từ Protein Data Bank (PDB), Class, Architecture, Topology and Homology (CATH), Structural Classification of Proteins (SCOP) và Molecular Modelling Databases (MMDB) cũng như là các công cụ mô phỏng trực quan hóa enzym như PyMOL, RasMol, Cn3D, UCSF Chimera, Molecular Graphic Library (MGL) và Visual Molecular dynamics (VMD)

Có rất nhiều dữ liệu được tạo ra từ các trình tự phân tử liên quan như DNA, RNA hay protein cần phải được thực hiên trên lý thuyết, do đó sinh học tính toán và tin sinh học giúp phân tích dữ liệu sinh học bằng nhiều cơ sở dữ liệu, công cụ dựa trên web và phần mềm liên quan. Do đó, các công cụ sinh học tính toán là rất cần thiết để nghiên cứu cơ sở phân tử của con đường xử lý sinh học các vật liệu độc hại. Tài nguyên sinh học tính toán cung cấp những dự đoán và hiểu biết quan trọng về các khía cạnh tế bào, phân tử và di truyền của quá trình giải độc cũng như là quá trình phân hủy của các đối tượng được nhắc đến.

Cơ chế phân hủy sinh học của nhựa polyme bằng hoạt động của vi sinh vật hoặc enzyme vi sinh vật có thể dễ dàng dự đoán và được nghiên cứu bằng nhiều cách tiếp cận sinh học tính toán khác nhau (Almeida và cộng sự, 2019). Hiểu được cấu trúc ba chiều của enzym và kiểu gấp nếp của chúng là điều cần thiết để nghiên cứu cơ chế phân hủy sinh học. Các enzym chính liên quan đến quá trình phân hủy sinh học là các hydrolaza serine như cutinase (EC 3.1.1.74), lipase (EC 3.1.1.3) và carboxylesterase (EC 3.1.1.1) và các phân nhóm như tannase, PET hydrolase và MHETase. Một số tài nguyên sinh học tính toán như Protein Data Bank (PDB); CLASS; Architecture, Topology and Homology (CATH), Structural Classification of Proteins (SCOP) và Molecular Modelling Databases (MMDB) và các công cụ trực quan hóa phân tử như PyMOL, RasMol, Cn3D, UCSF Chimera, Molecular Graphic Library (MGL) và Visual Molecular Dynamics (VMD) là rất cần thiết để hiểu cấu trúc không gian ba chiều và kiểu gấp nếp của các enzym này. Các cấu trúc 3D mô tả sự sắp xếp cấu trúc gấp cuộn bậc hai (xoắn alpha và phiến beta) của một số enzyme chính được thể hiện trong Hình 5.

Các nghiên cứu in silico giúp dự đoán sự liên kết giữa các polyme và các enzym của vi sinh vật, đồng thời đề xuất cơ sở cấu trúc và phân tử cho quá trình phân hủy nhựa do vi sinh vật (Bollinger và cộng sự, 2020). Nhiều cơ sở dữ liệu khác nhau được sử dụng để nghiên cứu công dụng của enzym, con đường trao đổi chất và hóa chất để quản lý chất thải nguy hại và xử lý môi trường đối với vật liệu nhựa.

Nhiều tài nguyên dữ liệu tính toán cũng như cơ sở dữ liệu được sử dụng nhằm xác định sự liên kết giữa các polyme phân tử với enzyme cũng như đề xuất các cấu trúc cơ sở và phân tử nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu sự phân hủy nhựa của vi sinh vật, cụ thể trong nghiên cứu về sự phân hủy sinh học của một loạt các hợp chất bao gồm các phân tử nhựa polymer các tài nguyên tính toán và cơ sở dữ liệu chính sau đây được sử dụng: NCLASS (Ghosh et al., 2013), OxDBase, KEGG (Kanehisa et al.,2017), Bionemo (Carbajosa et al., 2009), MetaCyc (Ahmed et al., 2018), BioCyc, ESIS (Leon-Zayas et al., 2019), UM-BBD (Ellis et al., 2006), MetaRouter (Pazos et al., 2005), BSD (Urbance et al., 2003), PAHbase(Kessner et al., 2008), MetaboLights (Kale et al., 2016), BioRadBase (Reena et al., 2012), KBase (Arkin et al., 2016), BiofOmics (Lourenco et al., 2012), v.v. Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng ba loài thuộc chi Pseudomonas và hai loài thuộc chi Bacillus có khả năng phân hủy PET đã được xác định bằng cách phân tích phân tích trình tự draft genome (không rõ (trình tự RNA) của chúng (Leon-Zayas và cộng sự, 2019). Chất lượng của trình tự được phân tích bằng Trimmomatic và FastQC, đồng thời các đoạn trình tự được phân tích có chất lượng cao được tập hợp lại bằng cách sử dụng SPAdes với các mô hình singletons chất lượng cao và các lần đọc trình tự hai chiều và được chú thích bằng Prokka, do đó số liệu bộ gen của các trình tự được xác định bằng QUAST. Người ta đã quan sát thấy rằng các gen liên quan đến hệ thống vận chuyển của các phân tử sinh học khác nhau và cho thấy các gen khác nhau mã hóa các enzym giống như lipase. Từ những dữ liệu đầu ra này, người ta đã tiết lộ rằng những vi sinh vật này đã tham gia vào quá trình khử nitrat đồng hóa và khử nitrat hòa tan. Các cơ sở dữ liệu khác nhau đã giúp phân tích các con đường trao đổi chất liên quan đến sự phân hủy của nhựa và cung cấp thông tin hữu ích trong các nghiên cứu về quá trình phân hủy của nhựa.

Các công cụ như FMM, BNICE (Karp et al., 2015), UM-PPS và DESHARKY và Metabolic Tinker là một số cơ sở dữ liệu và tài nguyên dự đoán con đường chính hữu ích trong nghiên cứu phân hủy sinh học và mô tả về các công cụ này được trình bày trong Bảng 3 (Arora và Bae, 2014; Leon-Zayas và cộng sự, 2019). Các công cụ sinh học tính toán cũng rất hữu ích trong việc dự đoán độc tính hóa học của các hợp chất khác nhau bao gồm cả polyme nhựa. Các công cụ Tin sinh học chính được sử dụng để dự đoán độc tính hóa học của polyme nhựa bao gồm Sarah Nexus (Ghosh và cộng sự, 2013), TOPKAT, ECOSAR (Krueger và cộng sự, 2015), VirtualToxLab, ToxiPred (Krueger và cộng sự, 2015) , HSDB, GENE-TOX (Kale và cộng sự, 2015) và ECOTOX (Danso và cộng sự, 2018) (Bảng 3).

Gần đây, các phương pháp giải trình tự metagenomic và tái cấu trúc metagenomic của shotgun đã được sử dụng để xác định các chi mới của Desulfobacteraceae, Desulfovibrio và Desulfobulbaceae, những vi khuẩn này là một phần không thể thiếu trong các nghiên cứu về sự phân hủy nhựa sinh học cũng như sư suy giảm lượng sulfat (Pinnell et al., 2019). Phân tích metagenomic được sử dụng cho S. Skariyachan et al. xác định các gen mới có liên quan đến sự phân hủy của PET. Các enzym thủy phân PET (PET hydrolase) từ cơ sở dữ liệu Integrated Microbial Genome (IMG) bằng phân tích cụm đã được nhận diện. Các dữ liệu xác định được khoảng 504 gen mới có liên quan dựa trên sự giống nhau trong trình tự axit amin và chúng cho thấy cho thấy rằng các PET hydrolase chủ yếu hiện diện trong một số ngành của vi khuẩn như xạ khuẩn, vi khuẩn proteobacteria và bacteroidetes. Các PET hydrolase có nguồn gốc từ ngành bacteroidetes trong metagenome của nhóm động vật sống dưới nước và xạ khuẩn trong metagenome của các nhóm động vật trên cạn được đề xuất đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy PET (Yousif et al., 2013).

Chi Pseudomonas có khả năng phân hủy LDPE đã được nghiên cứu bằng cách sắp xếp trình tự và tìm kiếm sự tương đồng bởi DNAMan, và các trình tự tương đồng tốt nhất đã được chọn từ cơ sở dữ liệu nucleotide bằng cách sử dụng phân tích BLAST (Bhatia et al., 2014). Phân tích phát sinh loài giữa chủng Pseudomonas đã được xác định và các vi khuẩn Gram âm khác với sự trợ giúp của thuật toán “maximum parsimony” (tạm dịch là giản lược hóa cây phát sinh) (dnapars) và thuật toán Maximum Likelihood (tối ưu hóa cây phát sinh) (dnamlk và dnaml) có sẵn trong phần mềm Phylip đã cung cấp mối quan hệ tiến hóa đáng kể (Bhatia et al., 2014) . Vi khuẩn này được xác định là một đoạn gen mục tiêu mới của Pseudomonas citronellolis EMBS027 có khả năng phân hủy LDPE sau khi phân tích cây phát sinh loài. Bằng cách sử dụng PHYML, các thuật toán Maximum Likelihood và “maximum parsimony” đã được khởi động và trình tự gen 16S rRNA được xác định bằng cách sử dụng UNA Fold như đã báo cáo trong nghiên cứu gần đây của chúng tôi (Skariyachan et al., 2015). Do đó, phân tích metagenome và so sánh phát sinh gen là những phương pháp sinh học tính toán mạnh mẽ để xác định các vi sinh vật phân hủy nhựa PE mục tiêu mới hay các loại nhựa khác.

Phân tích hệ phiên mã de novo được sử dụng để xác định quá trình trao đổi chất của Rhodococcus ruber trong quá trình phân hủy nhựa PE trong đó các đoạn phiên mã được ánh xạ tới bộ gen bằng cách giải trình tự RNA của chủng Rhodococcus ruber C208 thông qua rnaQUAST. Rockhopper, một công cụ toàn diện, thân thiện với người dùng để phân tích tính toán dữ liệu trình tự RNA của vi khuẩn, đã được sử dụng để phân tích các lần xuất hiện mRNA của từng cấu hình biểu hiện cho mỗi lần sao chép và chú thích gen được thực hiện trên các hệ phiên mã bị loại bỏ có liên quan đến việc biểu hiện sử dụng nhựa PE bởi Argot2 và Blast2GO (Ren và cộng sự, 2018).

Các phương pháp tiếp cận tin sinh học như lắp ghép (docking) phân tử là công cụ mạnh mẽ để mô hình hóa tương tác của các enzyme phân hủy nhựa và cơ chất của chúng. Các mô phỏng lắp ghép phân tử giúp hiểu được cơ chế phân hủy hydrocarbon bởi các enzyme vi sinh vật khác nhau. Những cách tiếp cận này mang lại bước đột phá về cơ chế khử độc của polyme và hiểu được cơ sở phân tử của việc liên kết các dẫn xuất hydrocacbon với túi liên kết của enzyme (Rengachari et al., 2013; Cao et al., 2011). Vị trí hoạt động của enzyme PETase đã được dự đoán bằng phần mềm Rosetta và các nghiên cứu mô phỏng động lực và lắp ghép phân tử đã chỉ ra rằng vị trí hoạt động của PETase linh hoạt hơn ở nhiệt độ phòng so với điều kiện ưa nhiệt của nó và PETase được phân lập từ Ideonella sakaiensis có khả năng phân hủy PET một cách hiệu quả ( Fecker và cộng sự, 2018). Trong một nghiên cứu khác, cấu trúc của MHETase đã được làm sáng tỏ bằng nhiều cách tiếp cận sinh học tính toán khác nhau và đặc tính cấu trúc của enzyme MHETase cũng được thực hiện bởi một số công cụ Tin sinh học. Enzim chính cho sự phân hủy PET và các trình tự tương đồng tốt nhất, bằng cách sắp xếp nhiều trình tự và phân tích phát sinh loài bằng thuật toán MEGA và BioNJ tương ứng, đã được tiến hành thực hiện để hiểu thêm cơ chế phân hủy {có lẽ là liên quan đến nhựa PET - phần này em chưa hiểu kỹ lắm} (Cossu et al., 2016; Palm et al., 2019). Bằng cách sử dụng các phương pháp sinh học máy tính khác nhau, việc xác định các nếp gấp mới và vị trí liên kết của các enzym chịu trách nhiệm cho sự phân hủy nhựa có thể được mô hình hóa. Các con đường trao đổi chất chính liên quan đến quá trình phân hủy sinh học có thể được xây dựng bằng nhiều công cụ tin sinh học khác nhau và cấu trúc tinh thể của các enzym khác nhau chịu trách nhiệm cho sự phân hủy của polyme nhựa có thể được truy xuất từ ​​cơ sở dữ liệu như PDB, CATH, SCOPE và MMDB. Với sự trợ giúp của nhiều công cụ sinh học điện toán khác nhau, các enzym phân hủy nhựa mới có thể được mô hình hóa khi không có cấu trúc tự nhiên của chúng, các đặc tính hóa học lập thể có thể được xác thực và dự đoán có thể được sử dụng để hiểu hơn cơ chế phân hủy sinh học như trong Hình 6 (Arora và Bae, 2014, Wei và cộng sự, 2017).

Bằng mô hình tính toán và mô phỏng lắp ghép, một trong các nghiên cứu đã đề xuất cơ chế liên kết của polyetylen terephthalate (ID PubChem: 18721140) và polystyrene sulfonate (PubChem: 75905) đối với cấu trúc ba chiều của lipase (cấu trúc mở, PDB: 2LIP) của một số loài thuộc chi Pseudomonas. Dự đoán cho thấy rằng polyme tương tác hiệu quả với túi liên kết của lipase và chứng minh những thay đổi về hình dạng (Skariyachan et al., 2015). Khi polyetylen terephthalate được gắn kết phân tử với lipase, năng lượng liên kết của các tương tác được AutoDock Vina ước tính là -4,3 kcal/mol (Trott và Olson, 2010). Dư lượng axit amin chính trong các mục tiêu tương tác với phối tử được tìm thấy là Leu127, Ser136 và Leu161, và các tương tác được ổn định bởi một số lực yếu (Hình 5G và H). Tương tự như vậy, khi polyme polystyrene sulfonate được gắn với enzyme lipase, phối tử thể hiện sự tương tác sâu sắc với lipase và phức hợp thụ thể-phối tử đã trải qua những thay đổi đáng kể về cấu trúc. Năng lượng liên kết liên kết với thụ thể và phối tử được ước tính là -5,5 kcal/mol. Dư lượng axit amin chính có trong khoang liên kết được xác định là Thr18, Leu27, Tyr29, Leu287, Leu290 và những dư lượng này tương tác với phối tử bằng một số tương tác yếu (Hình 5I và J). Do đó, sinh học máy tính đóng một vai trò quan trọng trong việc tìm hiểu cơ chế cấu trúc và phân tử của hoạt động của enzyme trong quá trình phân hủy nhựa. Phân tích trình tự, so sánh trình tự, tìm kiếm sự giống nhau, dự đoán phân tích cấu trúc bậc một, bậc hai và bậc ba của enzym, dự đoán các kiểu gấp nếp và các vùng rối loạn, dự đoán gen và phân tích phát sinh loài là một số phương pháp tiếp cận quan trọng của sinh học máy tính, và một số công cụ dựa trên web và phần mềm miễn phí có sẵn để nghiên cứu cơ sở phân tử của các enzyme cần thiết cho quá trình phân hủy sinh học (Arora và Bae, 2014). Dự đoán và mô hình hóa cấu trúc 3D của các enzym khi không có cấu trúc tự nhiên, phân tích vị trí liên kết của chúng, dự đoán năng lượng tối thiểu và sự phù hợp ổn định nhiệt động, mô hình hóa tương tác với các polyme nhựa khác nhau, phân tích độc tính của các polyme này và nghiên cứu mô phỏng động lực học phân tử của mô hình hóa tương tác là một số khía cạnh chính khác của sinh học tính toán và tin sinh học cần thiết để hiểu cơ chế phân hủy nhựa bởi các enzym vi sinh vật ở cấp độ phân tử. Hơn nữa, phân tích bộ gen so sánh và metagenomic của các enzym phân hủy nhựa mới và hồ sơ phiên mã của những sinh vật này mang lại một bước đột phá quan trọng để xác định các vi sinh vật phân hủy nhựa mới (Popovic và cộng sự, 2015; Purohit và cộng sự, 2020; Robinson và cộng sự, 2021 ). Các nghiên cứu tin sinh học và sinh học điện toán về các enzym phân hủy nhựa mới giúp cung cấp hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng phân loại của các enzym phân hủy nhựa khác nhau và cơ chế liên quan đến sự phân hủy sinh học của các polyme nhựa, các lĩnh vực có sẵn nhiều enzym mới và cung cấp cơ sở cho ứng dụng phân hủy nhựa dựa trên vi sinh vật ở quy mô công nghiệp (Zrimec et al., 2021).